Метод флуоресцирующих антител
Метод флуоресцирующих антител (МФА) (иначе реакция иммунофлуоресценции — РИФ) используется для обнаружения антигенов в биологических объектах (микроорганизмах, жидкостях) с помощью антител, помеченных флуоресцирующими красителями.
Первый люминесцентный микроскоп с кварцевой оптикой был сконструирован еще в 1908г. Келером и Зидентопфом. Сам метод иммунофлуоресценции был изобретен в 1942г. А. Кунсом, синтезировавшим органический краситель флуоресцеин-4-изоцианат, и разработавшим методику его конъюгирования с сывороточными белками.
Различают прямой (пМФА) или реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ), разработан. А Кунсом и Каплан. Непрямой (нМФА) метод флуоресцирующих антител или реакция непрямой иммунофлуоресценции (РнИФ), разработан Кунсом и Уиллером и, как разновидность последнего нМФА с комплементом.
ПМФА используется с целью выявления антигенов в биологических пробах на основе известных сывороток.
Методика пМФА. На предметном стекле фиксируется мазок или отпечаток ткани, содержащий антиген. На этот мазок наносится флуоресцирующая сыворотка, содержащая антитела против предполагаемого антигена. В качестве контроля используется гетерологичная флуоресцирующая сыворотка. В течение 30 мин.мазки с нанесенной сывороткой выдерживают во влажной камере при +37°С затем их промывают, удаляя лишний флуоресцин. Сыворотка, связываясь с антителом, образует комплекс, включающий флуоресцин, как опознавательный маркер. Оценка результатов осуществляется люминесцентным микроскопированием по уровню яркости зеленого свечения, описывается в крестах.
«+++++» — яркая, сверкающая флуоресценция;
«+++» — отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция;
«++» — флуоресценция слабая, но морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко;
«+» — флуоресценция очень слабая, морфология клеток различима плохо;
«-» — флуоресценция отсутствует.
НМФА используется с целью выявления специфических антител в биологических пробах.
Методика нМФА. При проведении нМФА на известный, фиксированный на стекле антиген, наносят испытуемую сыворотку и в течение 30 мин. мазки с нанесенной сывороткой выдерживают во влажной камере при +37°С. Затем наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма-глобулин и вновь выдерживают во влажной камере. Далее препараты промывают, высушивают и исследуют люминесцентной микроскопией. Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливающее свечение на «++», при наличии свечения на «+++» или «++++» в предыдущем разведении.
Модификацией нМФА, является нМФА с комплементом. В этом случае к сыворотке, нанесенной на антиген, добавляется комплемент, а к нему уже антикомплементарная люминесцирующая сыворотка.
Преимуществом непрямых методов является необходимость наличия только видовых люминесцирующих сывороток. При этом реакция становится более громоздкой из-за большого количества необходимых контролей. К недостаткам всех видов РИФ относится ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующей сыворотки на различных элементах препарата.
РИФ применяется в настоящее время для идентификации возбудителей различных вирусных инфекций, бешенства, колиэнтеритов, дизентерии, гепатита, брюшного тифа и паратифов, холеры, коклюша, чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, сифилиса, токсоплазмоза, хламидиоза, и др.
Для лабораторных исследований используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие глобулины к исследуемым антигенам.
Список литературы:
1. Р. Кирк Д. Бонагура Современный курс ветеринарной медицины Кирка. М., “Аквариум” 2005г.
2. Х.Г. Ниманд П.Ф. Сутер Болезни собак. М., “Аквариум” 1998г.
3. Бусыгин К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных М., “Колос” 1975г.
4.Сюрин В.М Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП 2004г.
5. Ветеринарная микробиология и иммунология под ред. Проф. Н.А.Радчука М., “Агропромиздат” 1991г.
Еще интересные статьи
В рубрике "Для владельцев"
